生物素親和素(又稱抗生物素)系統(tǒng)(biotinavidin system,BAS)標(biāo)記抗體的技術(shù)是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的一種新的免疫檢測方法。由于親和素與生物素間的親和力*,結(jié)合迅速,且極其穩(wěn)定,生物素標(biāo)記抗體和酶的標(biāo)記率高,又不影響蛋白的活性,使BAS標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度,為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的途徑。目前生物素和親和素(近年來,在BAS檢測中多用鏈霉親和素“streptavidin,SA”,它是鏈霉菌培養(yǎng)過程中的分泌物,完整的鏈霉親和素和從卵白中提取的親和素一樣,也由4條相同的肽鏈組成。因鏈霉親和素在檢測應(yīng)用中發(fā)生的非特異性結(jié)合遠較親和素低,因此日漸受重視,已有取代親和素之勢。
各種抗體或酶的標(biāo)記物在國內(nèi)已有商品供應(yīng),使用方便。BAS ELISA具有的特點:
①對于所有的抗原抗體系統(tǒng),包括免疫細胞化學(xué)、ELISA、免疫印跡法等都適用,應(yīng)用范圍極廣;
②BAS在溫和條件下可與各類生物大分子如蛋白質(zhì)、脂多糖等結(jié)合,并且這種結(jié)合對原生物大分子的生物活性無影響;
③每個親和素分子可與4個生物素分子結(jié)合,所以可以偶合更多連接生物素的酶分子,從而大大提高了靈敏度;
④生物素和親和素間親和力強,故二者一旦結(jié)合,就極為穩(wěn)定,不受在ELISA方法中的保溫及多次洗滌影響,而且這種結(jié)合反應(yīng)時間比抗原抗體反應(yīng)所需時間短;
⑤結(jié)果專一性強,非特異性顯色或染色背景極低;
⑥*抗體稀釋度高,可節(jié)約抗體。
原理
生物素或親和素與抗體分子或標(biāo)記物結(jié)合后,既不影響前者的親和力,也不改變后者的特性。親和素分子的4個活性部位并非都和連接在抗體分子上的生物素殘基結(jié)合,剩下的游離部位尚可作為另一種生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)的受體。這些特點就是BAS免疫標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)和原理。
BAS基本檢測方法可分為兩大類,一類以游離親和素居中,分別連接生物素化大分子反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素,稱為BAB法或橋聯(lián)親和素生物素法(bridged avidin biotintechnique,BRAB),其改良法稱為(avidinbiotin complex,ABC)法。另一類以標(biāo)記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系,稱為BA法或標(biāo)記親和素和生物素法(LAB)?,F(xiàn)分別介紹如下:
1.BA法亦稱LBA法。系將特異性抗體生物素化,將酶分子標(biāo)記在親和素分子上,生物素化抗體與被檢抗原結(jié)合后,再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)結(jié)到抗原分子上,經(jīng)酶促反應(yīng)即可檢出抗原。
2.BAB法亦稱BRAB法。系將特異性抗體生物素化,將酶分子標(biāo)在生物素上,然后以游離親和素橋聯(lián)物,使被檢抗原、生物素化抗體和酶標(biāo)生物素聯(lián)成一體。
3.ABC法原理與BAB法基本相同,只是親和素和酶標(biāo)生物素需要先按一定比例形成ABC復(fù)合物,這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合了大量的酶分子,當(dāng)親和素尚未被酶標(biāo)生物素飽和時,生物素化抗體即可與之結(jié)合。BASELISA的三種基本檢測法。
上述方法中,如將第二抗體生物素化,即為間接法。由于間接法增加了一級抗原抗體反應(yīng),因而比直接法更敏感,應(yīng)用范圍更廣。近年來許多學(xué)者對上述基本方法進行了改良,有人用親和素抗體或A蛋白作橋聯(lián)物。另外還發(fā)展了BAELISA競爭法和抑制法等。